假尿苷 （ Ψ ） 修饰 是 RNA 中丰度最高的修饰之一，广泛存在于 tRNA、rRNA、snRNA 及 mRNA 中，通过改变 RNA 的二 级结构、稳定性或与蛋白的互作，调控翻译效率、RNA 剪切等关键过程，在细胞应激、发育及疾病中发挥核心作用。从早期的全转录组初筛，到临床样本的定量分析，再到高分辨率的密集位点解析，直至单分子层面的原生 RNA 探究，Ψ-seq/Pseudo-seq、BID-seq、BACS 与纳米孔技术依次构建起 Ψ 修饰研究的技术阶梯。本文将介绍这四类主流技术的原理、实验流程及优劣势。

（一）Ψ-seq/Pseudo-seq

核心依赖 CMC（N - 环己基 - N'-(2 - 吗啉乙基) 碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐）特异性标记 ：CMC 可与 RNA 中的 U、G 和 Ψ 形成加合物，经碱性条件处理后，仅 Ψ-CMC 加合物稳定保留，其余加合物被逆转。Ψ-CMC 加合物会阻碍逆转录酶（RT）前进，导致 RT 在 Ψ 位点下游 1 个核苷酸处终止，通过高通量测序检测这些终止位点，对比 CMC 处理组（+CMC）与未处理组（-CMC），筛选出 CMC 依赖的特异性终止信号，即为 Ψ 位点。

1.样本制备与 RNA 提取：从酿酒酵母等样本中提取总 RNA，通过 oligo (dT) 纤维素珠富集 poly (A)+ RNA（适配 mRNA 检测）。

2.RNA 碎片化：用氯化锌随机断裂 RNA 为 60-150 nt 片段，确保转录组均匀覆盖。

3.CMC 标记与加合物逆转：+CMC 组用 0.5 M CMC 处理 RNA，-CMC 组用缓冲液替代；后续经碱性条件孵育，去除 U-CMC 和 G-CMC 加合物，仅保留 Ψ-CMC。

4.文库构建：修复 RNA 3' 末端环状磷酸基团，连接 3' 接头，进行逆转录合成 cDNA，凝胶纯化筛选截短 cDNA（对应 RT 终止产物），经环化和 PCR 扩增获得测序文库。

5.测序与数据分析：Illumina 平台测序后，通过 barcode 拆分、 adapter 修剪、基因组比对，识别 + CMC 组特有的 RT 终止位点，确定 Ψ 在转录组中的位置。

1.首次实现全转录组 Ψ 位点定位，可发现 mRNA、rRNA、tRNA 等多种 RNA 中的 Ψ 修饰，为 Ψ 功能研究奠定基础。

2.达到单核苷酸分辨率，能精准确定 Ψ 在 RNA 序列中的具体位置。

3.适配性广，可调整流程用于不同物种（只要能获得高质量 mRNA）。

1.无绝对定量能力：仅能定性判断 “是否存在 Ψ”，无法检测修饰比例（如 30%、70%）。

2.样本量需求高：需至少 2 μg poly (A)+ RNA，难以适配微量样本。

3.流程繁琐：涉及多步化学处理、凝胶纯化，操作复杂度高，易导致 RNA 损耗。

4.存在假阳性风险：RNA 二级结构等因素可能导致非特异性 RT 终止，需依赖多生物学重复（建议≥14 个）过滤。

5.无法区分连续 U 中的 Ψ：对密集修饰区域的检测效果受限，且不兼容低丰度 RNA 的精准分析。

（二）BID-seq

中性 pH 条件下亚硫酸氢盐可与 Ψ 定量反应形成 Ψ-BS 加合物，且不引发胞嘧啶（C）脱氨基（避免序列复杂性丢失）。Ψ-BS 加合物会导致逆转录酶（SuperScript IV）在修饰位点发生 “跳跃读取”，使 cDNA 对应位置出现碱基缺失；对比亚硫酸氢盐处理组（+BS）与未处理组（-BS），筛选出 BS 依赖的特异性缺失信号，即为 Ψ 位点，且缺失率与 Ψ 修饰比例正相关，可实现定量。

1.样本制备与 RNA 提取：从细胞或组织中提取总 RNA，富集 poly (A)+ RNA（适配 mRNA 检测），仅需 10–20 ng 输入 RNA。

2.RNA 预处理：将 RNA 片段化为适合测序的片段，修复 3' 末端环状磷酸基团，连接 5' 和 3' 测序接头。

3.亚硫酸氢盐修饰：+BS 组用优化后的亚硫酸氢盐试剂（2.4 M Na₂SO₃ + 0.36 M NaHSO₃）70℃孵育 3 小时，形成 Ψ-BS 加合物；-BS 组用缓冲液替代，作为对照。

4.文库构建：经脱硫、逆转录合成 cDNA（SuperScript IV 酶），PCR 扩增后纯化测序文库。

5.测序与数据分析：Illumina 平台测序后，通过比对基因组、计算缺失率，结合校准曲线（基于已知 Ψ 比例的合成 RNA），确定 Ψ 位点及修饰比例。

1.兼具单碱基分辨率与绝对定量能力：可精准定位 Ψ 位置，同时通过缺失率计算修饰比例（如 10%、50%），解决传统技术仅能定性的局限。

2.样本量需求低：仅需 10–20 ng RNA，适配微量样本（如临床活检组织、小鼠组织）。

3.序列复杂性保留：中性 pH 条件避免 C 脱氨基，不影响 RNA 序列完整性，减少 mapping 困难。

4.覆盖范围广：可检测 mRNA、rRNA、tRNA 等多种 RNA 的 Ψ 修饰，且能识别组织特异性 Ψ 位点。

1.特定序列背景存在干扰：部分含 ACΨ、CUΨ 等 motif 的未修饰 RNA 可能出现 10–25% 的背景缺失率，需通过严格筛选标准排除假阳性。

2.密集修饰区域检测受限：相邻 Ψ 位点可能因 “信号遮蔽” 导致低修饰比例位点漏检。依赖校准曲线：不同序列 motif 的 Ψ-BS 反应效率有差异，需通过合成 RNA 探针构建校准曲线，增加实验复杂度。

（三）BACS

利用 Ψ 独有的游离 N¹ 原子，与 2 - 溴丙烯酰胺发生加成反应，随后通过分子内 O²- 烷基化形成稳定的 nce¹,²Ψ 环化产物；未修饰的尿苷（U）因无游离 N¹，无法发生该反应，实现 Ψ 的特异性标记。nce¹,²Ψ 产物在反转录（RT）过程中碱基配对特性改变，不再与腺嘌呤（A）常规配对，而是被反转录酶识别为胞嘧啶（C），最终在 cDNA 中产生U-to-C 的特异性突变信号，通过突变率可直接定量 Ψ 的修饰水平。

1.RNA 样本预处理：提取总 RNA / 核糖体 RNA/PolyA+ RNA，经 DNase I 去除基因组 DNA 后，用镁离子试剂将 RNA 片段化为 100-200 bp 短片段，再通过 T4 多核苷酸激酶修复 RNA 3' 端，为接头连接做准备。

2.3' 接头连接与纯化：给修复后的 RNA 连接特异性 3' 接头，用 5'- 脱腺苷酶和 RecJ 核酸酶清除多余游离接头，纯化获得带 3' 接头的 RNA。

3.2 - 溴丙烯酰胺特异性修饰：将 RNA 与 250 mM 2 - 溴丙烯酰胺、625 mM 磷酸盐缓冲液（pH8.5）混合，85℃孵育 30 分钟，使 Ψ 发生环化修饰形成 nce¹,²Ψ 产物，经两次纯化去除未反应试剂。

4.反转录合成 cDNA：加入 RT 引物和 dNTP，通过反转录酶合成 cDNA；用 Exo I 消化多余引物，再用 NaOH 水解 RNA 模板并中和，纯化得到 cDNA。

5.cDNA 接头连接与 PCR 扩增：给 cDNA 连接双链接头，进行 10-12 个循环的 PCR 扩增，纯化后获得可用于测序的文库。

6.测序与数据分析：测序，结合 NNΨNN/NNUNN 合成 spike-in 校准，通过公式计算 Ψ 修饰水平，同时识别 A-to-I 编辑和 m¹A 修饰信号。

1.位点定位精准：通过 Ψ-to-C 的单碱基突变信号，可精准区分 连续尿苷序列 和 密集修饰区域 。

2.定量准确性高：通过合成 spike-in 构建校准曲线，与金标准 SILNAS 质谱的定量相关性 r=0.90，且 256 种序列基序中 230 种的 Ψ 转化效率＞85%。

3.多修饰同步检测：可在同一文库中同时检测 Ψ、A-to-I 编辑和 m¹A，实现 “一库多检”，无需额外构建多个文库，降低样本和试剂消耗。

1.样本需求量较高：实验需 50-200 ng 的 rRNA 或 polyA+ RNA，对低起始量样本（如微量临床样本）的兼容性不足，无法满足单细胞或微量体液样本的检测需求。

2.化学处理存在 RNA 降解风险：85℃的高温环化处理可能导致部分 RNA 片段降解，会轻微降低文库构建效率。

3.数据分析流程复杂：需结合 UMI 去重、基序特异性校准、多修饰信号区分等步骤，对生物信息学分析能力要求较高，且需定制化脚本（依赖 GitHub 开源代码），普通实验室难以快速复现。

（四）nanoRMS/NanoPsu

RNA 分子通过纳米孔时，会产生特征性电流强度信号；Ψ 作为尿苷（U）的异构体，其化学结构差异会导致两种关键信号变化 —— 一是碱基识别（base-calling）时出现特异性 “错误”（主要为 U→C 错配），二是电流强度和信号轨迹（trace）与未修饰 U 存在显著差异。通过专用软件（如 nanoRMS）提取单分子层面的电流强度、信号轨迹等特征，利用机器学习算法（KNN 或 K-means）区分 “修饰读段” 与 “未修饰读段”，统计修饰读段占比即可量化 Ψ 修饰比例；同时以敲除假尿苷合成酶（PUS）的菌株为对照，校准信号特异性。

1.样本制备与 RNA 提取：从细胞或组织中提取总 RNA 或富集 poly (A)+ RNA（适配 mRNA 检测），无需化学标记或抗体富集，保留 RNA 原生状态。

2.文库构建：对 RNA 进行 poly (A) 尾修饰（若为非 poly (A) RNA），连接纳米孔测序专用接头（RTA/RMX），形成 RNA:DNA 杂交链，无需 PCR 扩增，避免引入偏倚。

3.纳米孔测序：将文库加载到 ONT MinION 等测序平台，通过纳米孔实时检测 RNA 通过时的电流信号，获取单分子层面的原始信号数据（FAST5 格式）。

4.数据分析：先用 Guppy 等工具进行碱基识别（base-calling），筛选 Ψ 特有的 U→C 错配信号；再用 nanoRMS 软件提取电流强度、信号轨迹等特征，通过机器学习模型区分修饰与未修饰读段，最终输出 Ψ 位点定位及修饰比例。

1.无需化学修饰或抗体：直接检测原生 RNA，避免 CMC 标记、亚硫酸氢盐处理等步骤导致的 RNA 降解或偏倚，保留 RNA 天然修饰状态。

2.单分子分辨率与定量能力：既能定位 Ψ 位点（单碱基分辨率），又能通过单分子读段统计实现修饰比例定量（5%-100%），还可捕捉同一 RNA 分子上的多个修饰共存信息。

3.适配多种 RNA 类型：可检测 rRNA、tRNA、mRNA、snRNA/snoRNA 等多种 RNA 的 Ψ 修饰，还能同步分析 2′-O - 甲基化（Nm）等其他修饰。

4.实验流程简便：无需复杂文库构建步骤，避免 PCR 扩增，缩短实验周期，且能处理完整长度的 RNA 分子，保留异构体信息。

1.低丰度位点灵敏度不足：对 mRNA 等低丰度 RNA 中的低修饰比例位点（<10%）检测难度大，需极高测序深度（≥50 M reads），增加实验成本。

2.序列背景依赖性：部分序列上下文（如连续 U 或复杂二级结构区域）会干扰信号识别，导致假阳性或定位偏差，需结合其他技术验证。

3.数据分析复杂：依赖专用软件和机器学习模型，需校准碱基识别算法（如 Guppy）和映射工具（如 GraphMap），对生物信息学能力要求较高。

4.设备成本较高：需专用纳米孔测序平台（如 MinION），初期投入高于传统测序技术，且低修饰比例位点的定量准确性需依赖标准品校准。

下表是四种技术的对比：